פורמסולפורון הינו קוטל עשבים, מקבוצת הסולפוניל-אוריאה, המשמש להדברה בררנית לאחר הצצה של עשבים רעים דגניים ורחבי עלים בתירס,  ע"י עיכוב האנזים Acetolactate Synthase  (ALS)הגורר עיכוב בביוסינתזה של חומצות אמינו מסועפות בצמח. בפורמולציה המשווקת בישראל (אקיפ) פורמסולפורון משולב עם הסייפנר הבררני איזוקסדיפן-אתיל, שתפקידו להגן על התירס מפני פגיעת ק"ע, ללא הפחתה ביעילות הדברת עשבים רעים, ככל הנראה ע"י הגברה בררנית של ניטרול קוטל העשבים בגידול. על אף שהוא מיועד לתירס, ומורשה לשימוש בהדברת ע"ר במכלואי תירס שונים בישראל, קיימות עדויות רבות המצביעות על שונות בתגובת תירס מתוק וסופר מתוק לפורמסולפורון, כאשר ישנם זנים שנפגעים קשות מהטיפול בו (איור 1).

 

בעבודה זו נבחן מנגנון התגובה, ותורשת התגובה, לפורמסולפורון בגנוטיפים של תירס סופר מתוק.  השערות המחקר הן: 1) בגנוטיפים של תירס סופר מתוק הרגישים לפורמסולפורון מנגנון פירוק ק"ע בצמח אינו פעיל עקב פגם ישיר, או לחילופין פגם בתגובה לסייפנר איזוקסדיפן-אתיל ו-2) תורשת פנוטיפ התגובה היא מנדלית פשוטה- גן יחיד עם אלל דומיננטי לעמידות ורציסיבי לרגישות. כבסיס לעבודה שימשו ארבעה קווי תירס מטיפוס sh2- שני קווי הורים הומוזיגוטים ('IBER001' ו-'IBER002'), המכלוא של השניים ('ER00X') ומכלוא נוסף מרקע גנטי שונה ('11-484-PVS') (איור 2).

ישנם הבדלים מובהקים בין הקווים בתגובתם לריסוס אקיפ לאחר הצצה: 'IBER001' ו-'PVS' רגישים למינונים נמוכים של אקיפ, וערכיED50  שלהם הם 0.36 ו-4.36 גרם חומר פעיל (גח"פ) לדונם בהתאמה, לעומת 'IBER002' ו-'ER00X' שאינם נפגעים גם במינונים גבוהים עד פי 50 מהמינון המומלץ, וערכי ED50  שלהם הם 79.5 ו-42.1 גח"פ לדונם בהתאמה. הרגישות לאקיפ נבחנה גם בתנאי שדה ונמצא כי 'IBER001' לא שורד טיפול במינון המומלץ (45 גח"פ להקטר), לעומת 'IBER002' ו-'ER00X' ששרדו ללא פגיעה מהותית בהתפתחות (איור 3). המכלוא 'PVS' אינו אחיד בתגובתו- מרבית הפרטים לא שרדו טיפול באקיפ לעומת כ-20% מהפרטים ששרדו ללא פגיעה מהותית בהתפתחות. הבדלים בין הקווים בתגובה לאקיפ ניתנים לזיהוי במבחן ביולוגי, הבוחן התארכות הנצר של נבטי תירס לאחר טיפול קדם זריעה באקיפ, ומאפשר לאפיין את פנוטיפ התגובה בצורה פשוטה תוך חיסכון בזמן ומשאבים. במהלך העבודה נבחנה תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים נוספים. בכל הקווים, נמצאה התאמה בין פנוטיפ התגובה לאקיפ (רגיש/עמיד) ופנוטיפ התגובה לקוטל העשבים מעכב האנזים HPPD טמבוטריון + סייפנר: איזוקסדיפן-אתיל (לאודיס), והתאמה לפנוטיפ התגובה למעכבי ALS רימסולפורון (טיטוס), יודוסולפורון + סייפנר:מפנפיר (הוסאר) ושילוב של פורמסולפורון + יודוסולופורון + תיאנקרבזון-מתיל + סייפנר:ציפרוסולפמיד (מייסטר פאוור) בקווי 'IBER' והמכלוא שלהם (איור 4).

 

האפשרות של הבדלים בין הקווים ברגישות אתר המטרה של פורמסולפורון נשללה: לא נמצאו הבדלים בעיכוב In Vitro של ALS ע"י פורמסולפורון. בנוסף, לא נמצאו מוטציות ברצף החלבון, בשני אתרים אשר מוטציה בהם מקנה עמידות (איור 5).

 

הערכת התגובה לסייפנר איזוקסדיפן התבצעה ע"י יישום מפוצל ומשולב של פורמסולפורון וסייפנר טכני. תגובת ארבעת הקווים לריסוס לאחר הצצה של פורמסולפורון בלבד, ללא הסייפנר איזוקסדיפן, אינה שונה מהתגובה לאקיפ- הקווים הרגישים לא שרדו והעמידים לא נפגעו מטיפול פורמסולפורון במינון 45 (איור 6) ו-90 ג' להקטר. שילוב סייפנרים שונים בפורמולציות המסחריות, שהתגובה אליהן נבנחנה במהלך העבודה, וכן שילוב הסייפנרים דיכלורמיד ובנוקסקור עם פורמסולפורון, בפורמולציה שהוכנה במעבדה, לא הגן על הצמחים הרגישים לפורמסולפורון 'IBER001' ו-'PVS' מפגיעה.

אחד המנגנונים לניטרול קוטלי עשבים, בצמח בכלל ובתירס בפרט, הוא מודיפיקציות ע"י אנזימים ממשפחת Cytochrom P450, כשלב ראשון בתהליך תלת שלבי של מטבוליזם בצמח. על מנת לבחון מעורבות אנזימי Cytochrom P450 בפנוטיפ התגובה של תירס לאקיפ, רוססו קווי התירס השונים במלתיון – אורגנופוספאט מעכב פעילות אנזימי Cytochrom P450 לפני הטיפול בקוטלי עשבים. מלתיון במינון שיושם אינו פיטוטוקסי לתירס אך בעקבות טיפול מלתיון חלה עליה מובהקת בפיטוטוקסיות של קוטלי עשבים אקיפ (במינון 90 גח"פ להקטר בלבד) טיטוס והוסאר, על 'IBER002' ו-'ER00X'. נמצא כי קיים אנטאגוניזם בפעילות מלתיון והסייפנר איזוקסדיפן: עליה בפיטוטוקסיות ל-'IBER002' ו-'ER00X' התרחשה בעקבות טיפול משולב של מלתיון ופורמסולפורון (ללא הסייפנר) במינון 45 ג' להקטר, בעוד לאחר טיפול משולב במלתיון + פורמסולפורון + איזוקסדיפן לא נראתה השפעה כנ"ל- עובדה המעידה על השפעה חיובית של הסייפנר על פעילות אנזימי Cytochrom P450 (איור 6).

 

המנגנון המשוער לעמידות של קווי תירס סופר מתוק במחקר זה לפורמסולפורון הוא פירוק ע"י אנזימי Cytochrom P450. בקווים 'IBER001' ו-'PVS' מנגנון הפירוק כפי הנראה פגום ולכן הם בעלי רגישות מוגברת לפורמסולפורון. על מנת לבחון את ההשערה כי תורשת התגובה לפורמסולפורון היא מנדלית פשוטה, נבחן הפנוטיפ בצאצאי הכלאות שונות: צאצאי הכלאות רציפרוקליות של קווי ההורים 'IBER002' ו-'IBER001' אינם שונים בתגובתם לאקיפ, עובדה השוללת תורשה אמהית של הפנוטיפ. צאצאים מדור F2 של המכלוא 'ER00X', וצאצאי הכלאות מחזירות שלו עם קו ההורה הרגיש, מתפצלים בתגובתם לאקיפ ביחס שאינו שונה במובהק מ-1:3 ו-1:1, עמידים:רגישים בהתאמה, לעומת זאת בהכלאה מחזירה עם ההורה העמיד כל הצאצאים עמידים (איור 7).

 

צאצאים מדור F2 של המכלוא 'PVS'  וצאצאי הכלאת מבחן עם הקו הרגיש 'IBER001' הינם בעלי פנוטיפ רגיש, בעוד צאצאי הכלאת מבחן עם הקו העמיד 'IBER002'  בעלי פנוטיפ עמיד. ממצאים אלו מאששים את ההיפותזה כי תורשת התגובה לאקיפ הינה מנדלית פשוטה- גן יחיד בעל אלל דומיננטי לעמידות (R) ואלל רציסיבי לרגישות (s). הגן Nsf1- בעל אלל יחיד דומיננטי (Nsf1) ואלל רציסיבי (nsf1)- אופיין בעבר כקשור בפנוטיפ התגובה של תירס לקוטלי עשבים המפורקים ע"י אנזימי Cytochrom P450 (ביניהם פורמסולפורון). שני סמנים גנטים פולימורפים- bnlg1382 ו-dupssr1- שמופו בעבר ונמצאו בתאחיזה לגן זה נבחנו בעבודה זו. מופע הסמנים הנ"ל פולימורפי בין קווי ההורים 'IBER001' ו-'IBER002', ונמצא בקורלציה לפנוטיפ התגובה לאקיפ במכלואים ובצאצאים מדור F2 (איור 8).

 

ממצאים אלו, נוסף על ממצאים לגבי מעורבות אנזימי Cytochrom P450 בתגובה לאקיפ, מעלים את הסברה כי הגן Nsf1 מבקר את תגובת גנוטיפים של תירס סופר מתוק שנחקרו בעבודה זו. הגנוטיפ המשוער של כל אחד מהקווים הוא: nsf1nsf1 ('IBER001'), Nsf1Nsf1 ('IBER002'), Nsf1nsf1 ('ER00X') ו- nsf1nsf1 ('PVS').